El complejo y flexible ARN de interferencia.


Una técnica aclamada como un triunfo de la “ingeniería genética de precisión ‘ ha demostrado ser absolutamente lo opuesto.

Al menos desde el 2003 se sabe que el ARN de interferencia (ARNi) – un proceso por el cual una secuencia corta de ARN regulador de 7 a 21 nucleótidos puede bloquear (silenciar) la expresión de genes específicos – no es tan específica como se ha promocionado, por lo que su aplicación para la modificación genética es muy peligrosa (ver [1] New GM Nightmares with RNA, SiS 58).

MicroRNAs:  RNAs pequeños con un papel importante en la regulación de genes.

Las investigaciones de la última década ha producido una serie de “reglas canónicas” que rigen la interacción entre los reguladores cortos microARNs (miARNs) y sus mARNs diana de la siguiente manera.

1. Las interacciones son mediadas por la región “semilla”, un largo fragmento de 6-8 nt en el extremo 5 ‘ (cabeza) del miARNque forma pares de bases perfectas (Watson-Crick), con el objetivo o diana.

2. Los nucleótidos emparejados fuera de la región semilla estabilizan las interacciones, pero no influyen en la eficacia del miARN.

3. Los objetivos del miRNA funcional se encuentran cerca de los extremos del 3′ (final de cola) UTRs (regiones no traducidas) de genes codificadores de proteínas.

Sin embargo, se han descubierto recientemente muchas excepciones a las reglas – interacciones de nucleótidos abombados [1] (debido a las bases no emparejadas); emparejamiento de G-U tambaleado (en lugar de U-A o G-C), falta de vinculación de semillas, con múltiples desajustes, abombamientos y tambaleos, abombamiento de G en el objetivo; miRNA vinculante en la UTR 5 ‘ del mARNy dentro de las secuencias de codificación; y vinculación dentro de los ARN no codificantes derivados de pseudogenes – todo lo cual es resumido por un equipo de investigadores de la Universidad de Edimburgo en el Reino Unido [2 ]: “En conjunto, estos datos indican que los miARNs se pueden unir a una amplia variedad de objetivos con emparejamientos de bases canónicos y no canónicos, e indican que las reglas de focalización del miARN pueden ser complejas y flexibles.”

Las células humanas expresan más de 1 000 miARNs, lo cuales se pueden unir a cientos de mRNAs, pero sólo una pequeña fracción se ha identificado experimentalmente. El equipo de investigación ha utilizado una técnica especialmente desarrollada para capturar el miARN unido a sus objetivos, entrecruzarlo y luego secuenciar los duplicados de ARN de las bases apareadas de miARN objetivo. Encontraron que las excepciones superan en número a las interacciones basadas en reglas.

Mientras que la unión de la mayoría de los miARNs incluye las regiones semilla 5 ‘, alrededor del 60% de las interacciones de las semillas son no canónicos (no de acuerdo a las reglas). Contienen abombamientos o nucleótidos mal apareados. Por otra parte, las interacciones de las semillas son generalmente acompañadas por específicos apareamientos de bases no-semillas. Sólo alrededor del 37% de las interacciones de las semillas implican las pares de bases ininterrumpidas de Watson-Crick. Aproximadamente el 18% de las interacciones miARN-ARNm implican el final de la cola de regiónes no-semilla del miARN, con poca evidencia de contactos en la cabeza de la semilla. Las especies de miARN difieren sistemáticamente en sus interacciones en el ARN diana, y se han encontrado fuertes motivos sobrerepresentados en los sitios de las interacciones de varios miRNAs.

La mayoría de lo objetivos miARN son los ARNm, que comprenden el 70% de las interacciones; otros objetivos incluyen pseudogenes y ARN no codificante (nc) intergénico, un números sustancial de ARN ribosomal, ARN de transferencia, pequeños ARN nucleares y miRNAs.

Las 18 514 interacciones miARN-ARNm que representan 399 miRNAs diferentes y 6 959 genes codificantes de proteínas se han analizado en detalle.

Muchas interacciones caracterizadas de miARN implican una complementariedad perfecta entre la región 5 ‘miRNA, en particular los nucleótidos 2-8 (secuencia semilla) y el ARN diana. En comparación con las secuencias al azar, los datos muestran un fuerte enriquecimiento para las semillas exactas (Watson-Crick, “semilla canónica”) y casi exactas ( pares G-U, hasta un desajuste o abombamiento de “semilla no canónica”). Pero las interacciones de semillas no canónicas son ~ 1,7 veces tan comunes como el apareamiento de bases perfecto.

Los sitios diana identificados de los miARN son marcadamente conservadores con respecto a las regiones flanqueantes en un análisis de 46 genomas de vertebrados, apoyando su importancia biológica. Las regiones con una más alta conservación son típicamente el elemento semilla (nt 1-8) y una región corriente abajo (nt 13-19).

Un análisis matemático (media K) de la agrupación separó cinco clases de interacciones de acuerdo con los diferentes patrones de apareamiento de bases. Las interacciones de clase I-III implican las todas las regiones semilla, mientras que las interacciones de clase 1 (19%) se limitan a la región semilla, las clases II y III implican además los nucleótidos 13-16 y 17-21 del miARN, respectivamente. La clase IV (16%) de la unión se limita a una región en el centro y en el extremo de la cola del miRNA y la clase V implica un apareamiento de bases distribuida o menos estable. La La conservación evolutiva y la diana de baja regulación son más fuertes en la clase II. Dos tercios de todos los miRNAs analizados muestran una distribución no aleatoria a través de las cinco clases de apareamiento de bases. La mayoría de los miARN se enriquecen en las clases I-III de interacción de semillas, pero otros mostraron un mayor enriquecimiento de la clase IV no-semilla. Hay una prevalencia de interacciones de no-semilla en general.

Los resultados son verificados por experimentos de transfección [3], por ejemplo, mediante la inserción de potenciales secuencias diana en UTR 3′ de luciferasa para observar la baja regulación de la luciferasa para la semilla miR-92a y /o regiones de unión 3′.

Pero ese no es el final de la historia. Los resultados se han obtenido en las células de riñón embrionario humano (HEK) crecidas en cultivo, no se aplican a otras células o tejidos en diferentes entornos. Los investigadores comentan al final [2]: “Más en general, se espera que el espectro de las interacciones de los genes miARN-mRNA cambie rápidamente durante la diferenciación, y la infección viral y después de cambios metabólicos o insultos ambientales.”

¿Cómo puede alguien todavía pensar que es seguro aplicar ARNi en la modificación genética?

Referencias

  1. Ho MW. New GM nightmares with RNA. Science in Society 58.
  2. Helwak A, Kudla G, Dudnakova T and Tollervey D. Mapping the human miRNA Interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell 2013, 153, 654-65. MRC Human Genetics Unit, Institute of Genetics and Molecular Medicine, University of Edinburgh

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Dr. Mae-Wan Ho | i-sis.org.uk

Una traducción de Disiciencia

Imagen de  Nature Reviews Genetics 5, 522-531- He, L., et. al.

Notas del Traductor

[1] A partir de1os orígenes de replicación se crea un abombamiento en el ADN de doble hélice que es visible por microscopia de electrón. Estos abombamientos también son llamados “horquillas o burbujas de replicación” y representan los sitios de síntesis del ADN (Figura 3).

[2] Aunque los condicionamientos estéricos (de orientación) para el apareamiento de bases son rigurosos para las dos primeras bases de un codón hay cierto grado de libertad de apareamiento para la tercera base. Esta libertad estérica se define como tambaleo, para el apareamiento de la posición 3 (base en 3´) de un codón y de la posición 1 (base en 5´) de un anticodón.

[3] La transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos u otras “herramientas” para la transferencia.

 

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