Mezclando genomas: mutaciones inducidas por la manipulación genética de plantas.


Sumario ejecutivo del informe Genome Scrambling – Myth or Reality? Transformation-Induced Mutations in Transgenic Crop Plants.
Allison Wilson, PhD, Jonathan Latham, PhD. y Ricarda Steinbrecher, PhD.
Traducido por Disiciencia.

El informe original(2004) escrito en inglés de la fundación EcoNexus, se puede descargar aquí o leer directamente aquí.

Abreviaturas:
AFLP: fragmento largo de polimorfismo amplificado, bp: pares de bases, FISH: hibridación fluorescte in situ, Kbp: pares de kilobases, PCR: reacción en cadena de polimerasa (método de amplificación del ADN), RFLP: longitud restringida de fragmento de polimorfismo, T-ADN: ADN transferido, las secuencias de ADN contenidas entre los bordes izquierdo y derecho de las repeticiones del plásmido Ti de Agrobacterium que son transferidas al genoma de la planta durante la transformación mediada por Agrobacterium, plásmido Ti: tumor plásmido inductor,  USDA: Departamento de Agricultura de Estados Unidos.

Esquema de transferencia mediada por Agrobacterium (izquierda) y por bombardeo de partículas (derecha). Imagen tomada de viewzone.com

Introducción

A nivel internacional, las normas sobre seguridad de los cultivos de plantas transgénicas (genéticamente modificadas o GM) se han centrado primordialmente en analizar los problemas que puede surgir de los transgenes y sus productos (por ejemplo, la alergenicidad de la proteína Cry3A de B. thuringiensis).Este énfasis en el transgen y su producto es una característica del enfoque caso por caso, para la evaluación de riesgos. El enfoque caso por caso efectivamente asume que los métodos de transformación de plantas (las técnicas utilizadas para introducir ADN recombinante en una planta) no tienen riesgo inherente. Sin embargo, los actuales métodos de transformación de plantas de cultivo típicamente requieren el cultivo de tejidos (es decir, la regeneración de una planta intacta desde una sola célula que ha sido tratada con hormonas y antibióticos y obligada a seguir los cambios anormales de desarrollo) y la infección, ya sea con un organismo patógeno (A. tumefaciens) o el bombardeo de partículas de tungsteno. Por tanto, no es sorprendente que la transformación de plantas resulte en importantes consecuencias genéticas que no estaban relacionadas con la naturaleza específica del transgén. En efecto, tanto el cultivo de tejidos como la inserción del transgén han sido utilizados como agentes mutagénicos (Jain 2001, Krysan et al. 1999).

En este informe se examinan las mutaciones introducidas en los cultivos transgénicos por la transformación de plantas. Hemos buscado y analizado la bibliografía científica pertinente para la transformación mediada por Agrobacterium y el bombardeo de partículas, lss dos métodos de transformación de plantas más utilizados. También hemos analizado los datos moleculares presentados a la USDA en las aplicaciones que solicitan la aprobación comercial de variedades transgénicas. Por último, hemos examinado si las mutaciones que surgen de la transformación de plantas tienen el potencial de ser peligrosas y si las pruebas de seguridad actuales son lo suficientemente robustas como para detectar mutaciones peligrosas antes de llegar al mercado.

Mutaciones inducidas por Transformación:

En teoría, la transformación de plantas podría resultar en la inserción exacta de un transgén único sin alteración genómica adicional. En la práctica esto rara vez o nunca se produce. Como se demuestra en este informe, además de los transgenes, cada genoma de la planta transformada contiene un espectro único de mutaciones resultantes de (a) los procedimientos de cultivo de tejidos, (b) los métodos de transferencia de genes como la transferencia mediada por Agrobacterium o el bombardeo de partículas o, (c ) la inserción del transgén y (d) inserción de ADN superficial (1). Estas mutaciones inducidas por la transformación se pueden separar en dos tipos: las que se introducen en el sitio de inserción del transgén, a lo que nos referimos como mutaciones del sitio de inserción y las que se introducen en otros lugares por azar, las cuales nos referimos como mutaciones a lo largo del genoma.

Mutaciones  en el sitio de inserción:

Nuestra búsqueda de la literatura primaria reveló que se sabe muy poco acerca de las mutaciones creadas en el sitio de inserción del transgén en los cultivos transgénicos. Esto es cierto tanto para la inserción de transgenes a través de la transformación mediada por Agrobacterium (Sección 1.1) así como para el bombardeo de partículas (punto 1.2). Esta falta de comprensión es causada en parte por la falta de grandes estudios sistemáticos sobre las mutaciones en el sitio de inserción (secciones 1.1.5 y 1.2.4). Adicionalmente, muchos de los datos disponibles provienen de la investigación de una planta que no es de cultivo, Arabidopsis thaliana, y no está claro si estos resultados se pueden aplicar a las plantas de cultivo.

La transformación mediada por Agrobacterium:

La transformación mediada por Agrobacterium se ha utilizado para crear cultivos comerciales desde hace más de 10 años y es conocida por crear mutaciones en el sitio de inserción (Tabla 2, sección 1.1). Sin embargo, sólo ha habido un estudio a gran escala de las mutaciones creadas en los eventos (2) de inserción que contiene un solo inserto T-DNA (3) (el tipo de evento preferido para fines comerciales;. Forsbach et al 2003). En este estudio de 112 eventos de inserción de una sola copia del ADN-T de A. thaliana, los investigadores encontraron que la integración exacta de T-ADN casi nunca se produjo (Forsbach et al., 2003). La mayoría de las inserciones de ADN-T resultaron en pequeñas deleciones (1-100 pares de bases) de secuencias genómicas de plantas en el sitio de inserción. Sin embargo, para un número significativo (24/112) no había evidencia de reordenamiento a gran escala del ADN genómico de las plantas en el sitio de inserción. Dos de estos eventos de inserción contenian translocaciones cromosómicas. El resto tenía reordenamientos que no fueron caracterizados totalmente. Se sabe, sin embargo, que las reordenaciones de ADN genómico en sitios de inserción de T-ADN pueden ser muy importantes. Una deleción de 78Kbp (eliminación de 13 genes) es la más grande registrada en la inserción de T-ADN (Kaya et al. 2000) y otros investigadores han reportado la duplicación y translocación de un segmento de ADN de al menos 40 Kbp de tamaño (Tax y Vernon, 2001). La inserción de ADN Superfluo es también una característica común de los sitios de inserción de T-ADN (secciones 1.1.1-1.1.3). Por ejemplo, Forsbach et al. (2003) encontraron que 8 de sus 112 eventos de copia única de inserción de T-ADN también tenían grandes inserciones de plásmidos superfluos o secuencias de T-ADN. La mayoría de las líneas restantes tenían inserciones de 1-100 pb de ADN de origen indefinido.

Los resultados de estos y otros estudios sugieren que la gran mayoría de los eventos de inserción de T-ADN incluyen alteraciones genómicas pequeñas o grandes de ADN e inserciones de ADN superfluo.

La transformación por bombardeo de partículas:

El bombardeo de partículas se ha utilizado para crear numerosos cultivos comerciales (Tabla 2). Aunque puede dar como resultado la interrupción genómica a gran escala, existen pocos estudios que detallen las mutaciones en los lugares de inserción derivadas del bombardeo de partículas (punto 1.2). Por otra parte, no ha habido estudios sistemáticos a gran escala de esas mutaciones.
La mayoría de los eventos por inserción mediante partículas de bombardeo que se describen en la literatura científica son extremadamente complejos (Pawlowski y Somers, 1996). Varias copias de ADN repartido se intercalan a menudo con fragmentos pequeños o grandes de ADN genómico de plantas (Kohli et al., 2003). Un estudio informó incluso de una inserción de ADN cromosómico bacteriano en el sitio de inserción del bombardeo de partículas (Ulker et al. 2002).

Sin el uso de PCR y de secuenciación de ADN, los análisis de mutaciones del sitio de inserción son propensos a ser incompletos. Hemos encontrado sólo dos estudios de bombardeo de partículas, donde los análisis de PCR y de secuenciación de ADN se utilizaron para caracterizar las mutaciones creadas en los eventos de inserción de una sola copia que habían sido aisladas de plantas intactas. En un artículo (Makarevitch et al. 2003), 3 eventos de inserción fueron analizados, en el otro (Windels et al. 2001), fue analizado el evento de inserción 40-3-2 de la soja comercial Roundup Ready ®. Las mutaciones presentes en cada uno de estos cuatro eventos de inserción ‘simples’ aparecieron para incluir deleciones genómicas a gran escala y / o reordenamientos, además de tramos revueltos de ADN genómico y de ADN transferido (Makarevitch et al. 2003, Windels et al. 2001). Por ejemplo, además de la intención del transgén EPSPS4 descrita en la aplicación original, el evento 40-3-2 de la soja incluye un fragmento de 254 pb del gen EPSPS (4), un segmento de 540 pb de ADN no identificado, un segmento de ADN de la planta y otro fragmento de 72 pb de EPSPS, así como otras alteraciones genómicas no especificadas (Windels et al. de 2001, petición USDA 93-258-01P). Estas mutaciones de los eventos de inserción sólo se informaron después de la comercialización de la soja Roundup Ready ®. Es interesante que el análisis independiente de otra variedad comercializada sugiere que el evento de inserción MON810 del maíz YieldGard ® también incluye adicionales no especificados y no declarada previamente las mutaciones del sitio de inserción (Hernández et al., 2003).

Para los eventos de inserción por bombardeo de partículas, no pudimos encontrar ningún estudio de la secuencia del sitio de inserción de un transgén comparada a satisfación con en el sitio original inalterado (Sección 1.2.4). De este modo, nunca se ha informado sobre el alcance completo de la mutación del sitio de inserción por un bombardeo de partículas, ya sea en la literatura científica o en las solicitudes presentadas a los reguladores (5). La secuencia de datos existentes que describen los eventos de inserción por bombardeo de partículas son extremadamente limitados. Sin embargo, estos datos sugieren que la integración de los transgenes en los eventos de inserción por bombardeo de partículas siempre van acompañados de una alteración genómica substancial y de inserciones de ADN superfluo.

El análisis Southern blot es insuficiente para identificar todas las mutaciones del sitio de inserción:

Otra limitación para la comprensión de las mutaciones del sitio de inserción es que la técnica más comúnmente utilizada para analizar los eventos de inserción de transgenes para la investigación y con fines reglamentarios es la hibridación Southern blot (Kohli et al., 2003). Los análisis de los sitios de inserción del transgén por otras técnicas tales como FISH, PCR o secuenciación de ADN indican que el análisis Southern blot no es suficiente para determinar de forma fiable ya sea la presencia de ADN superfluo o el grado de alteración genómica en el lugar de inserción del transgén (Secciones 1.1. 4 y 1.2.3). Por ejemplo, Mehlo et al. (2000) utilizaron tanto PCR como el análisis de Southern blot para analizar los eventos de inserción por bombardeo de partículas y la conclusión fue que el Southern blot fue útil sólo en la detección a gran escala de las características del sitio de inserción del transgén. En otro estudio, las técnicas de fibra de FISH se utilizaron para analizar un evento de inserción por bombardeo de partículas que fue predeterminado por el análisis Southern Blot utilizado para contener repeticiones en tándem de un transgén (Svitashev y Somers, 2001). Su análisis reveló únicamente 3-10 kbp de ADN cromosómico entre la mayoría de las repeticiones. Esto sugiere que, en algunos casos, el análisis Southern blot es inadecuado incluso para la identificación de reordenamientos a gran escala.

Estos y otros informes nos llevan a conclusiones diferentes. En primer lugar, que el análisis de las líneas transgénicas basadas exclusiva o principalmente en los datos del análisis por Southern blot pueden perder muchas de las mutaciones presentes en los sitios de inserción. Así, el genoma de la planta se ve probablemente más afectado por la inserción de transgenes de lo que comúnmente se supone. En segundo lugar, que, como casi todas las aprobaciones comerciales de productos transgénicos o cultivos se basan principalmente en el análisis de la inserción del transgén mediante el Southern blot (Tabla 2, Apéndice), es probable que la mayoría de los eventos transgénicos actualmente aprobados para el uso comercial contienen mutaciones no declaradas de gran y pequeña escala en el sitio de inserción de los transgénes.

Mutaciones a lo largo de todo el genoma:

En este informe se examinan también los conocimientos actuales acerca de las mutaciones que son introducidas como resultado del cultivo de tejidos y por procedimientos de transferencia de genes, pero que no están asociados a la inserción del transgén (Sección 2). Hay 5 estudios en los que los investigadores han tratado de cuantificar el número de mutaciones introducidas en la transformación de plantas (revisado en Sala et al., 2000). Estos investigadores utilizaron análisis de polimorfismo del ADN (basadas en RFLP, AFLP y otras técnicas de PCR) para comparar los genomas de las plantas transformadas con los genomas de las plantas no transformadas usadas como control. Sus resultados sugieren que muchos cientos o miles de estas mutaciones a lo largo del genoma se presentan de manera recurrente en las plantas transformadas, utilizando los métodos típicos de transformación, especialmente aquellos que implican el uso de técnicas de cultivo de tejidos vegetales (Sección 2.3). En un estudio, Labra y col. (2001) se estima que el “valor de similitud genómica” de las plantas de control fue del 100%, pero sólo del 96 – 98% de las plantas transgénicas. En otras palabras, las mutaciónes genéticas muy extendidas habían resultado de los procedimientos de transformación de plantas. Aunque el número de mutaciones encontradas en estos estudios eran altos, la naturaleza de las técnicas analíticas utilizadas en estos experimentos sugieren que estas cifras pueden subestimar el grado de mutación para el genoma completo de la planta (Sección 2,5). Además, estos estudios no se refieren a la naturaleza de estas mutaciones, tales como si son de pequeña escala o de grandes cambios genómicos o si se producen en las regiones funcionales del genoma.

Dependiendo de la extensión de cruzamiento o retro-cruzamiento sufrido por el transformante primario, muchas veces y en la mayoría de las mutaciones creadas en el transformante primario probablemente que se presentan en los cultivos comercializados (Sección 4.3). Incluso en los casos de retrocruzamiento han sido extensas, a lo largo de todo el genoma, las mutaciones genéticamente vinculadas al sitio de inserción del transgén, por lo que probablemente permanecerán en los cultivos comerciales.

Se han encontrado mutaciones del genoma en todas las plantas transformadas y examinando tales mutaciones se ha demostrado que son heredables (Sala et al. 2000). Sin embargo, la normativa vigente de seguridad no requiere ningún tipo de pruebas o análisis de mutaciones del genoma en los cultivos comerciales.

La importancia de las mutaciones inducidas por transformación:

Las mutaciones del sitio de inserción, y las que se producen por todo el genoma pueden ser peligrosas si se producen en una región funcional del ADN de la planta (Sección 3). Las mutaciones en el ADN funcional de la planta, incluyendo secuencias de genes de codificación o secuencias reguladoras, pueden tener implicaciones para el rendimiento agronómico, o de interacciones del medio ambiente ,o para la salud humana o animal. Por ejemplo, una mutación inducida por transformación podría interrumpir un gen cuyo producto esté implicado en la biosíntesis de nutrientes, lo que resultaría en la alteración de niveles de nutrientes, o podría perturbar o alterar un gen implicado en la regulación o síntesis de compuestos tóxicos para los seres humanos. La alteración de un gen que codifica una proteína reguladora, como un factor de transcripción, podría resultar en la ausencia de expresión de numerosos genes. Estos cambios bioquímicos son impredecibles y difíciles de identificar incluso con numerosas pruebas bioquímicas (Kuiper et al., 2001). Típicamente, sólo unas pocas pruebas bioquímicas son requeridas por los reguladores. Por lo tanto, usando las actuales evaluaciones de seguridad, muchos de los nocivos fenotipos derivados de las mutaciones inducidas por la transformación, es poco probable que se identifiquen antes de su comercialización.

La frecuencia de interrupción del ADN funcional por mutaciones inducidas por la transformación:

La limitada cantidad de datos disponibles sugiere que con frecuencia los transgenes se insertan cerca o en las secuencias de genes (6) (Sección 1.1.6). En las especies de plantas estudiadas, el análisis de secuencia de ADN para los sitios de inserción del T-ADN sugiere que aproximadamente el 35-58% de las inserciones de transgenes interrumpen secuencias de genes de las plantas (Forsbach et al. 2003, Jeong et al. 2002, Szabados et al. 2002) . Estudios similares para los transgenes transportados a través de bombardeo de partículas no se han llevado a cabo nunca (Sección 1.2.5).

A pesar de su importancia para la evaluación de la seguridad, no está claro si los transgenes en las líneas comerciales se han insertado en o cerca de las secuencias de los genes. La mayoría de las solicitudes presentadas a la autorización del USDA para la comercialización de una línea transgénica no reportan la secuencia del ADN genómico de acompañamiento de los transgenes insertados, ni una comparación con la secuencia del sitio objetivo original (Tabla 2, Apéndice). Una dificultad añadida en la determinación de la importancia de un evento de inserción es que actualmente no es posible saber con certeza si esta región del genoma no es functional (7). Son necesarios cambios tanto en las prácticas transgénicas en materia de fitomejoramiento como para la regulación de los cultivos transgénicos para que las mutaciones peligrosas se pueden prevenir, identificar y eliminar, antes de su comercialización.

Como se analiza en este informe, los cultivos de alimentos no son inherentemente seguros. Todas las plantas producen sustancias nocivas y muchos cultivos alimenticios se derivan de ancestros no comestibles y pueden contener tejidos u órganos tóxicos. Por lo tanto, tienen dentro de sí el potencial genético para causar daño. En consecuencia, la estabilidad genética de cultivos en las piscinas de cría de plantas es crucial para que los criadores de plantas puedan producir cultivos razonablemente seguros. La presencia de mutaciones inducidas por la transformación representa una potencial y muy grave amenaza para la estabilidad, además de que es totalmente innecesaria. En adición, el grupo de cultivos disponibles para los agricultores está disminuyendo y algunos se cultivan a gran escala en todo el mundo. En consecuencia, garantizar la seguridad de los cultivos comerciales de transgénicos representa un gran reto para los gobiernos e instituciones involucrados en la regulación de bioseguridad.

______________________________________________

1. El ADN superfluo se define como cualquier otro ADN transferido de una sola copia del transgén deseado e incluye: secuencias de marcadores de genes, secuencias de plásmido bacteriano, fragmentos de ADN genómico bacteriano y copias adicionales completas o parciales del transgén.
2. Un evento de inserción de transgenes consiste en el transgén y sus secuencias de acompañamiento.
3. El T-ADN es el segmento de ADN delimitado por los bordes del T-ADN que se transfiere a una planta a través de transformación mediada por Agrobacterium. El T-ADN contiene el transgén deseado y con frecuencia también ADN marcador. Es trasnferido por el plásmido Ti y a veces ADN del plásmido que está fuera de las fronteras del T-ADN también es transferido.
4. Los genes EPSPS (5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa) de Agrobacterium sp. La cepa CP4 confiere tolerancia al herbicida glifosato.
5. Makarevitch et al. (2003) fueron capaces de comparar el sitio de inserción de un fragmento de 296 pb de transgén con su sitio diana. Encontraron que el evento de inserción incluía reordenamientos del ADN genómico que flanqueaban el fragmento y una supresión de 845 pb de ADN genómico.
6. Cabe señalar que, debido a que las células o plantas que contienen el transgén se identifican generalmente mediante la selección para la expresión de un gen marcador, los actuales métodos de transformación de plantas son activados para seleccionar los eventos de inserción que se producen en las regiones del genoma de transcritos funcionales (y por tanto rico en genes).
7. Otros factores aumentan la dificultad en determinar si la inserción en una región particular del genoma o la presencia de una determinada mutación del sitio de inserción se produce sin consecuencias. En otros eucariotas superiores, son comunes las interacciones de largo alcance de regulación (Carter et al., 2002). En otras palabras, las secuencias reguladoras pueden ser cientos de Kbp lejos del gen que codifica secuencias o incluso actuar en trans. También hay pruebas de que en muchos casos los genes que están agrupados en el genoma y que este orden de genes pueden ser importantes para la regulación genética (Hurst et al. 2004).
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